2021年6月18日，中華人民共和國海關(guān)總署發(fā)布了2021年第45號公告。關(guān)于《進口再生鋼鐵原料檢驗規(guī)程》等76項行業(yè)標準發(fā)布，其中《國境口岸恙蟲病東方體實時熒光PCR檢測方法》SN/T 5332-2021自2022年1月1日起實施，本文對該行業(yè)標準進行解讀。

海關(guān)總署公告2021年第45號及附件

一、恙蟲病是什么

恙蟲病由恙蟲病東方體引起，以鼠類為主要傳染源的自然疫源性疾病。臨床上以發(fā)熱、焦痂或潰瘍、淋巴結(jié)腫大及皮疹為特征。我國古代稱恙蟲病為沙虱熱，廣東稱為元寶瘡、爪子瘡，福建平潭稱三陽病，浙江永嘉稱楊梅病、六月客等。

自我國廣東省報告首例恙蟲病病例以來，恙蟲病疫區(qū)已由海南、廣東、福建、浙江等省區(qū)擴展到山東、江蘇、山西、黑龍江、吉林、遼寧以及天津等省市。2006年報告恙蟲病病例數(shù)1244例；2007年報告1332例、死亡1例；2008年報告2592例、死亡3例，恙蟲病流行呈上升趨勢。研究表明，已有10屬21種鼠類自然感染恙蟲病東方體，恙蟲病已經(jīng)成為我國重要的鼠源性自然疫源性疾病，對人類健康構(gòu)成極大威脅。

二、檢測對象是什么

本標準檢測對象包括國境口岸及出入境交通工具、集裝箱、貨物、行李等場所采集的鼠類樣品，國境口岸疑似恙蟲病患者的臨床樣品。

鼠類是出入境交通工具中常見的病媒生物之一，可隨飛機、輪船等載體在國境口岸之間擴散。歷史上多次發(fā)生由于鼠類入境造成疫病暴發(fā)流行的事例。1898年，一艘汽船將染有鼠疫耶爾森菌的褐家鼠（Rattus norvegicus）從印度帶到了馬達加斯加島，褐家鼠在該島大量繁殖，使當(dāng)?shù)厥笠哳l繁發(fā)生。近年來，我國衛(wèi)生檢疫機構(gòu)在北京、上海、寧波、成都等口岸的入境飛機、輪船、集裝箱中查獲大量的鼠類。

鼠類的輸入對我國國境口岸的衛(wèi)生安全構(gòu)成嚴重威脅，國境口岸是防范病媒生物輸入的第一道防線。加強對出入境交通工具及集裝箱、貨物等的排查和對輸入性鼠類攜帶病原體的監(jiān)測檢測，是有效防止傳染病通過口岸輸入、輸出，避免疫情大范圍暴發(fā)的基礎(chǔ)和前提，也是國境口岸檢疫執(zhí)法和疾病監(jiān)測的迫切需要。

三、本標準中檢測方法

本標準采用實時熒光PCR檢測方法對待檢樣品進行檢測。參考恙蟲病東方體Karp、Gilliam、Kato血清型56-kDa蛋白基因序列，設(shè)計并合成上下游引物及Taqman-MGB探針，擴增片段大小為130 bp。

以Karp型基因序列（GI:63079111）為例，對引物擴增區(qū)域核酸序列分別向兩側(cè)外延，構(gòu)建質(zhì)粒作為陽性對照。適當(dāng)稀釋，當(dāng)檢測Ct值在20~35之間，進行分裝備用。

序列如下：

GAAAAAAATTATGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGCGTTGTCGTTGCCATTTTCAGCTAGTGCAATAGAATTGGGGGAAGAAGGATTAGAGTGTGGTCCTTATGCTAAAGTTGGAGTTGTTGGAGGAATGATTACTGGCGTAGAATCTGCTCG。

四、標準方法檢測條件及系統(tǒng)評價情況

實時熒光PCR反應(yīng)體系

以LightCycler 480I 型實時熒光定量PCR儀器為例，反應(yīng)條件如下：

50 ℃ 2分鐘；95 ℃ 10分鐘；95 ℃ 15 秒，60 ℃ 1分鐘，循環(huán)45次，退火時收集熒光信號。熒光通道為FAM。由于不同實時熒光定量PCR儀性能有差異，可根據(jù)實際儀器型號，對檢測程序略作調(diào)整。

1

敏感性及線性評價情況

本標準提供的恙蟲病東方體實時熒光定量PCR檢測方法，定量關(guān)系曲線線性擬合系數(shù)R2=0.9988，檢測敏感性為54.5個拷貝。

敏感性擴增曲線圖

定量關(guān)系曲線

2

特異性及重復(fù)性評價

本標準提供檢測方法與莫氏立克次體（R.mooseri）、普氏立克次體(R.prowazekii)、立氏立克次體（R.brasiliensis）、Q熱立克次體（C.burnetii）、嗜吞噬細胞無形體（A.phagocytophi）及伯氏疏螺旋體（B.burgdorferi）無交叉反應(yīng)。批內(nèi)及批間重復(fù)性變異系數(shù)均小于5%。

特異性試驗擴增曲線

重復(fù)性實驗結(jié)果

五、結(jié)果判讀

1

質(zhì)量控制

有效實驗應(yīng)同時滿足如下條件：

—— 陽性對照有擴增曲線，且Ct值≤35；

—— 陰性對照及空白對照無Ct值，或Ct值≥40，且無擴增曲線。

2

陰性結(jié)果

在有效實驗條件下，待檢樣品Ct值≥40，且無典型擴增曲線，判為陰性，報告為待檢樣品恙蟲病東方體核酸陰性（實時熒光PCR法）。

3

陽性結(jié)果

在有效實驗條件下，陽性結(jié)果判斷及報告如下：

—— 待檢樣品Ct值≤35，且出現(xiàn)典型擴增曲線，判為陽性，報告為待檢樣品恙蟲病東方體核酸陽性（實時熒光PCR法）；

—— 如待檢樣品35＜Ct值≤40，且出現(xiàn)典型擴增曲線，需要復(fù)檢，復(fù)檢后Ct值仍在35~40之間，且出現(xiàn)典型擴增曲線，判為陽性，報告為待檢樣品恙蟲病東方體核酸陽性（實時熒光PCR法）。否則判為陰性，報告為待檢樣品恙蟲病東方體核酸陰性（實時熒光PCR法）；

—— 如待檢樣品40＜Ct值≤45，且出現(xiàn)擴增曲線，建議采用濃縮方式處理核酸樣品后復(fù)檢，復(fù)檢后Ct值有明顯減小趨勢，且擴增曲線有典型對數(shù)增長期，判為陽性，報告為待檢樣品恙蟲病東方體核酸陽性（實時熒光PCR法），此類樣品建議采用其他檢測方法進行確認。否則判為陰性，報告為待檢樣品恙蟲病東方體核酸陰性（實時熒光PCR法）。

六、生物安全及防污染要求

生物安全應(yīng)遵循GB 19489和WS 233 中相關(guān)規(guī)定，本方法中恙蟲病東方體實時熒光PCR檢測應(yīng)在生物安全2級（BSL-2）實驗室內(nèi)進行；PCR防污染要求應(yīng)遵循WS/T 230中相關(guān)規(guī)定。